Dear Dr. Woodard, > What method do you use to dissociate the cells from the dish? I send you a brief protocol of preparation of CHO suspension. If you have some difficulties to read in french - let me know. I will try to translate the text. > What diameter nozzle do you use for these >cells? I routinely use a 70um nozzle for most animal cell applications. I use 70um also. This is an example of settings for the sorter. NORM-R/3 DEB 950 cellules/sc Ab 120 Fr. de trie 80 SHEAT PRESSURE 10 (home-made PBS pH 7.2) DD 13.5 DDF 25618 SAMPLE DIFF 1.05 >What is usual elapsed time from dissociating cells, labelling cells and >sorting cells to transferring them to cell culture flasks? Up to 5 hours for 10x10^6 cells. Best regards SÎlection de la population de cellules CHO stablement exprimantes le rÎcepteur de***, ÎtiquetÎ par le myc. 1. a) Ensemencer une culture de CHO È 2x10^6 dans 10 ml de milieu de culture (MC) par boÔte de Petri. (5 boÔtes). b) prÎparer 2 tubes* 2058 Falcon contenants 2 ml MC-20 % FBS. Humecter les parois de tubes en utilisant l'agitation douce sur le Vortex. Ranger les tubes È 4°C. 2. Cultiver les cellules 24 heures dans l'incubateur (5% CO2; 37°C) 3. Rincer la monocouche de cellules 3 fois par PBS, afin d'enlever les cellules mortes et ‘‘demimortes‘‘. 4. Ajouter 1 ml de VERSEN** dans chaque boÔte, incuber 3-4 min (temp. amb). Enlever le VERSEN. Ajouter 2 ml de PBS-2%FBS. DÎcoller les cellules en pipetant la suspension plusieurs fois. 4. Incouber la suspension cellulaire È 16-18°C en prÎsence de l'anticorps a-myc durant 1 heure. 5. Laver les cellules 1 fois par centrifugation et resuspension dans PBS-2%FBS. 6. Incuber la suspension cellulaire 30 min È 16-18°C en prÎsence de l'anticorps a-IgG murin couplÎs au FITC. Apporter au manipulateur de trieur 4 tubes 2058 Falcon avec 4 ml de PBS par tube. PrÎvenir le manipulateur que vous commencez le deuxiÏme marquage. Au besoin laisser le message au 1-4867. 7. Laver les cellules 1 fois par centrifugation et resuspension dans PBS-2%FBS. 8. DÎterminer la concentration de la suspension et ramener la È 4x10^6 cell/ml. Filtrer la suspension dans un tube 2058 Falcon È travers une mÏche avec les mailles de 100um. Apporter au manipulateur de trieur la suspension des CHO marquÎes et les deux tubes 2058, Falcon contenants 2 ml MC 20 % FBS (cf. 1b). La suspension cellulaire doit Ðtre È la tempÎrature ambiante, le milieu MC 20 % FBS - dans la glace. * 0650002-053 Tube È culture 12x75 ** 15040-066 (Gibco) 0,2 g/l (0,53 mM) EDTA*4Na dans PBS
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