F. Revelles Marín, F. Arrebola Vargas, Nader Shahin
INTRODUCCIÓN
La versatilidad de los estudios que pueden realizarse mediante la citometría de flujo y la gran variación tanto estructural como en la localización celular de los epítopos antigénicos hace que existan numerosos procedimientos metodológicos de fijación y permeabilización celular. En este sentido, incluso el orden en el que se empleen los agentes fijador y permeabilizador puede ser un factor importante para la obtención resultados óptimos (Giloh, 1993; Larsen, 1994). De hecho estos factores son de gran importancia para la determinación de la glicoproteína P en citometría de flujo, de cuyo procedimiento técnico existen innumerables variantes.
Debido a que el anticuerpo monoclonal seleccionado para el reconocimiento de la glicoproteína P (Gp-P) puede identificar epítopos intra- o extracelulares de dicha proteína y ello condiciona en gran medida el procedimiento técnico de fijación y permeabilización celular se exponen en primer lugar algunos aspectos sobre el panel básico de anticuerpos disponibles en el mercado español para a continuación describir el procedimiento técnico más idóneo en cada caso.
ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE A GLICOPROTEÍNA P
Tanto sobre células normales como tumorales la detección por citometría de flujo o inmunohistoquímica de la Gp-P puede realizarse con los siguientes anticuerpos monoclonales (AcMo):
a) JSB-1:
Caracterizado por Scheper (Scheper et al., 1988), se obtuvo de células ováricas de hámster chino que eran resistentes a la Colchicina. Para que el AcMo se una a la P-170 es necesario que la membrana de la célula no está intacta, lo que indica que el epítopo reconocido por este AcMo es intracitoplasmático. Más concretamente, se encuentra muy próximo al que se une el AcMo C219. El isotipo de este anticuerpo es IgG1 y recientemente se ha reconocido que al menos para la detección inmunohistoquímica de la Gp-P es el que proporciona resultados mejores y más constantes (Tòth et al, 1994).
b) C-219:
Caracterizado por Kartner (Kartner et al., 1985), detecta un epítopo intracitoplasmático que en el análisis de la proteína de hámster, se corresponde con un segmento de 6 aminoácidos situados cerca de los dominios ATPasa dependientes más cercanos al N-terminal. El isotipo de este AcMo es IgG2.
La mayoría de los problemas que provoca la utilización de este anticuerpo dependen de que presenta algunas reacciones cruzadas. Así, Weinstein et al (1990) han descrito la expresión de una proteína reactiva distinta a Gp-P frente al C-219 que se sitúa en el Aparato de Golgi (G-C219-RP) y está fundamentalmente presente en individuos del grupo sanguíneo A.
Por otra parte también se ha descrito reactividad cruzada con la sorcina una proteína presente en las células musculares estriadas (Thiebaud et al, 1989).
c) MRK-16:
Obtenido por Hamada y Tsuruo (Hamada et al., 1986) detecta específicamente a la P-170 humana codificada por el gen MDR1 (Naito et al., 1992) ya que no reacciona frente a la de ratón, rata o mono. El epítopo al que se une se encuentra en la superficie externa de la membrana celular, parece ser doble e incluye el primer y el cuarto dominio extracelular quedando separados entre sí por una secuencia de 625 aminoácidos, lo cual indica que ambos dominios deben estar espacialmente cercanos (Georges et al., 1993). Aunque se describe que este epítopo es resistente a los aldehidos y a las proteasas en nuestra experiencia la se¤al que proporciona es débil y muy modificable en función del pretratamiento a que sean sometidas las células. La tinción del MRK16 detectable en la membrana plasmática y en la luz del aparato de Golgi, con muy débil tinción en el retículo plasmático sugiere que este AcMo podría detectar alguna de las pociones glicosiladas de la Gp-P (Willingham et al., 1987).
d) C-494:
Este AcMo detecta la expresión de P-170 específicamente codificada por el gen MDR-1 humano y pgp1 en el hámster; más concretamente se une a un pequeño fragmento cercano a los dominios ATP dependientes que se hallan en la mitad C-terminal (Georges et al., 1990).
e) C-32:
Se ha caracterizado solamente frente a P-170 de hámster (Georges et al., 1990) y reconoce una secuencia de 13 aminoácidos situados entre los dos dominios ATP dependientes de la mitad C-terminal. No es útil para tejido humanos ni de ratón.
f) 265/F4:
Caracterizado por Lathan et al. (1985) es de utilidad sobre todo en patología experimental para el reconocimiento de las proteínas codificadas por los genes mdr1a y mdr1b del ratón (Barrand & Twentyman, 1992).
g) HYB-241 Y HYB-612:
Son anticuerpos que al igual que el MRK-16 se unen a una región extracelular de la P-170, reconociendo además manera específica a su isoforma de 180 kD (Meyers et al., 1989).
h) UIC2:
Reconoce un epítopo extracelular mal definido y se ha utilizado hasta el momento experimentalmente como posible terapia de bloqueo de la Gp-P (Mechetner et al., 1992).
i) MH171:
Se trata de un anticuerpo artificial compuesto por ingeniería genética con fines eminentemente terapéuticos y que contiene la porción variable del monoclonal MRK16 mientras que el resto de la molécula es IgG común (Ariyoshi et al., 1992).
j) 4E3:
Es un anticuerpo de la clase IgG2a que reconoce específicamente un epítopo externo de la P-170 codificada por el MDR1 pero no la del MDR3 (Arceci et al., 1993). De entre todos los anticuerpos mencionados, los que se han utilizado en la mayor parte de los trabajos referidos en la literatura son los tres primeros (JSB1, C219 y MRK-16), y desde luego son los que más fácilmente se adquieren en nuestro mercado. Del mismo modo, nuestra experiencia personal en citometría se refiere exclusivamente a estos tres anticuerpos.
Además, existen también anticuerpos policlonales comercializados por diferentes compa¤ías de diagnóstico que son poco empleados en inmunohistoquímica debido a que provocan una fuerte coloración inespecífica de fondo. asimismo, en citometría de flujo estos anticuerpos son de escasa utilidad.
La principal dificultad práctica que plantea el manejo de los anticuerpos purificados existentes en el mercado (como ya se ha mencionado C219, JSB1 y MRK-16), es que los resultados que proporcionan son inconstantes y de difícil interpretación ya que en gran medida dependen del procedimiento utilizado para fijar y permeabilizar las células ya que la Gp-P es una molécula inestable, fácilmente enmascarable y, probablemente susceptible de ser interiorizada en la propia membrana plasmática dependiendo del estado funcional de las células que la contienen.
En principio podría parecer que los anticuerpos más idóneos son los que reconocen epítopos extracelulares como el MRK-16 ya que permitirían eliminar cualquier manipulación previa a la inmunotinción. Sin embargo en nuestra experiencia en líneas celulares con fenotipo MDR+ indica que la se¤al proporcionada por el anticuerpo es muy débil en estas condiciones mientras que se incrementa de forma notable tras fijación en formaldehído o paraformaldehído. En lo que se refiere al anticuerpo C219, es el único marcado con FITC disponible en España hasta 1994 aunque en forma de un kit comercial. respecto al mismo y tras haberlo utilizado personalmente puede decirse que ofrece unos resultados escasamente satisfactorios, dependientes de forma fundamental de tres factores concurrentes: 1) El anticuerpo monoclonal C219 proporciona relativamente baja señal en relación al anticuerpo JSB1; 2) El procedimiento de fijación para Gp-P contemplado en el kit (metanol al 1% a 4øC), se ha mostrado poco idóneo ya que origina una fuerte señal fluorescente no específica que enmascara los casos con positividad débil y 3) el anticuerpo de control negativo incluido en el kit ofrece una gran positividad inespecífica que contribuye a dificultar la interpretación de resultados.
Por este motivo, nuestro grupo recomienda realizar la determinación de Gp-P mediante técnica indirecta empleando el anticuerpo primario JSB1 que en nuestra experiencia proporciona resultados más reproducibles y con se¤al más intensa que cuando se utilizan C219 o MRK-16.
PROCEDIMIENTO DE FIJACIÓN-PERMEABILIZACIÓN CELULAR PARA LA DETERMINACIÓN DE GLICOPROTEÍNA P
En cuanto a los agentes de fijación empleados en citometría pueden clasificarse en dos grandes grupos (Giloh 1993; Larsen, 1994): agentes exclusivamente fijadores y agentes que simultáneamente son fijadores y permeabilizadores de la membrana celular. Entre los agentes exclusivamente fijadores merece especial mención fundamentalmente los derivados de aldehídos que fijan fundamentalmente a través de un proceso de reticularización proteica (García del Moral & Aguilar, 1993). Entre estos agentes los dos más importantes son el formaldehído y el paraformaldehído. El tamaño celular después de la fijación con aldehídos se altera en menor medida que mediante la fijación con acetona o alcoholes por lo cual en nuestra experiencia son de elección, sobre todo en el caso de la Gp-P donde la estabilidad de la membrana plasmática parece ser esencial para que se obtengan resultados reproducibles. Pese a ello, los aldehidos determinan mayor fluorescencia inespecífica, un hecho que hay que tener en cuenta en el caso de la Gp-P y prácticamente obliga en los casos con baja se¤al a incluir no sólo un control isotípico negativo sino un control positivo, ya sea una línea celular con fenotipo MDR inducido o alguna otra que exprese constitutivamente la Gp-P como la línea MDCK de túbulo renal (García del Moral et al, 1995).
Evidentemente, cuando se utiliza el mejor anticuerpo disponible (en nuestra opinión el JSB1), que reconoce un epítopo intracitoplásmico, es necesario permeabilizar la membrana celular. En este sentido existen numerosos detergentes no iónicos como Tritón X-100, Nonidet P- 40 o Tween 20 (Clevenger et al., 1985). Nuestros ensayos con agentes que fijan y permeabilizan de forma simultánea como el metanol han sido escasamente satisfactorios para la determinación de P-gp mediante inmunofluorescencia indirecta, hecho que contrasta con lo descrito por algunos otros investigadores (Epstein et al., 1989).
Por ello y en nuestra experiencia, la fijación- permeabilización debe realizarse de forma secuencial (en este último caso empleando tween 20 que es el agente permeabilizante que menos altera la forma y granularidad celular, salvo que se decida emplear el producto PermeafixR que se comenta a continuación. La introducción en el mercado español del producto Permeafix(R) como un agente universal para producir de forma simultánea la fijación y permeabilización celular ha abierto nuevas perspectivas en la estandarización del procedimiento más idóneo para la determinación de antígenos intracelulares por citometría de flujo. De hecho, un estudio comparativo practicado por nuestro grupo sobre los diferentes efectos morfológicos producidos a nivel celular por los agentes fijadores y permeabilizantes más usuales y el propio Permeafix(R) ha mostrado resultados muy alentadores, de manera que al estudiar mediante microscopia electrónica de barrido la superficie y tamaño celular, la conservación estructural inducida por el Permeafix(R) superaba de forma muy notable a la de los restantes agentes ensayados. Sin embargo y pese a estos excelentes resultados en la conservación morfológica celular, en el caso de la detección por citometría de flujo de la Gp-P, el PermeafixR sobre células humanas o en cultivo no ha proporcionado resultados tan reproducibles como la combinación paraformaldehido al 3.7%-tween 20 al 0.2%. Por el contrario y como se comenta en otra ponencia de este workshop, cuando se trata de determinar Gp-p sobre linfocitos de sangre total de rata, los resultados han sido excelentes.
En función de todo lo expuesto anteriormente, el procedimiento técnico que a continuación se desarrolla puede considerarse el estándar para la determinación de Gp-P sobre células humanas incluyendo elementos normales o neoplásicos de sangre periférica.
PROCEDIMIENTO DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA LA DETERMINACIÓN DE GLICOPROTEÍNA P
DETECCIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA P-170 EN SANGRE TOTAL
AcMo JSB1 (MONOSAN)
1. LISIS DE LOS HEMATÍES
100 µl sangre
2 ml solución de lisado
Temperatura ambiente
10-15 minutos
2. CENTRIFUGAR
900 g, 3 minutos
3. LAVAR
2 ml PBS-BSA añadidos sobre el botón celular
900 g, 3 minutos
4. FIJAR
Formaldehído 3.7 %
500 µl sobre el botón celular
Temperatura ambiente
10 minutos
5. AÑADIR 1.5 ml PBS-BSA sobre el formaldehído
900 g, 3 minutos
6. LAVAR
2 ml PBS-BSA sobre el botón
900 g, 3 minutos
7. PERMEABILIZAR
Tween-20 0.2 %
400 µl sobre el botón celular
Temperatura ambiente
15 minutos
Oscuridad
8. AÑADIR 1.5 ml PBS-BSA sobre el tween-20
900 g, 3 minutos
9. LAVAR
2 ml PBS-BSA añadidos sobre el botón celular
10. BLOQUEAR LA REACTIVIDAD INESPECÍFICA DE LOS ANTICUERPOS
100 µl suero humano AB 2 % sobre el botón celular
4°C
30 minutos
11. AÑADIR 2 ml PBS-BSA sobre el plasma humano
900 g, 3 minutos
12. INCUBAR CON EL ANTICUERPO PRIMARIO
10 µl AcMo no diluido sobre la suspensión celular
4°C
30 minutos
13. AÑADIR 2 ml PBS-BSA sobre la suspensión celular
900 g, 3 minutos
14. LAVAR
2 ml PBS-BSA añadidos sobre el botón celular
15. INCUBAR CON EL ANTICUERPO SECUNDARIO
100 µl Ac2º-FITC
Dilución 1/20 en PBS-BSA y suero humano AB 2 %
4°C
30 minutos
Oscuridad
16. AÑADIR 2 ml PBS-BSA sobre la suspensión celular
900 g, 3 minutos
17. LAVAR, AÑADIENDO SOBRE EL BOTÓN CELULAR
1.5 ml PBS-BSA
0.5 ml tween-20 0.2 %
18. FIJAR DURANTE LA NOCHE
Formaldehído 1 %
1-2 ml
19. LECTURA DIRECTAMENTE EN EL CITÓMETRO DE FLUJO
ABS Program
Protocolo JSB1
REACTIVOS
1. SOLUCIÓN DE LISADO (Ortho)
1 vial "Lysis buffer reagent"
100 ml agua destilada
Almacenar a temperatura ambiente
Caducidad de la solución reconstituida aproximadamente 7 días
2. PBS (Sigma)
Tabletas para la preparación de tampón fosfato sódico
pH 7.4
3. ALBÚMINA BOVINA SÉRICA (BSA, Sigma)
0.1 % (p/v) en PBS
4. FORMALDEHIDO (Probus)
3.7 % (v/v) en PBS-BSA
3.7 ml formaldehído de Riqueza = 35-40 %
96.3 ml agua destilada
1.0 % (v/v) en PBS-BSA
1 ml formaldehído de Riqueza = 35-40 %
99 ml agua destilada
5. TWEEN-20 (Polyoxyethylene-sorbitan monolaurate, Sigma)
0.2 % (v/v) en PBS-BSA
200 µl tween-20
100 ml agua destilada
6. SUERO HUMANO AB
Obtenido en el Servicio de Hematología
2 % (v/v) en PBS-BSA
20 µl suero humano AB
1 ml PBS-BSA
7. ANTICUERPO SECUNDARIO (Biomeda)
Dilución 1/20 en PBS-BSA y suero humano AB 2 %
Preparación de 2 ml de solución
40 µl suero humano AB
100 µl Ac2º-FITC
1860 µl PBS-BSA
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