Los virus animales permeabilizan las células en dos momentos bien definidos durante la infección: 1) En estadios tempranos, cuando el virus tiene acceso al citoplasma celular y 2) durante la expresión del genoma vírico dentro de la célula. Los mecanismos moleculares que rigen estos procesos son claramente diferentes. Mientras que las modificaciones tempranas de la permeabilidad están inducidas por las propias partículas víricas, la modificación de la permeabilidad de la membrana en fases tardías es producida por proteínas víricas que son sintetizadas de novo en la célula y que poseen actividades que recuerdan a proteínas del tipo de los ionóforos o toxinas que actúan en membrana.

Uno de las principales características de estos cambios tardíos de permeabilidad es el hecho de que requieren de la expresión del genoma viral, lo que implica que uno o varios productos virales son los responsables. Por tanto hay que tener en cuenta dos aspectos: por un lado 1) la naturaleza de las modificaciones de membrana a nivel molecular y por otro 2) la identidad de los productos responsables de esta modificación. El concepto de que el efecto citopático producido por los virus citolíticos está mediado por la expresión de uno o varios genes víricos está ganando en consistencia frente a la idea de que el acumulo de partículas víricas en el interior de la célula es el principal responsable del efecto citopático. Estas proteínas víricas involucradas en citopatogenicidad tendrían en la membrana celular su diana de actuación, sugiriéndose su capacidad para formar pequeños poros en la bicapa lipídica, que actuarían como ionóforos. Estamos hablando de la identificación de una nueva familia de proteínas víricas que aumentan la permeabilidad, que se han dado en llamar viroporinas. Son , en general, proteínas cortas de 50-120 aa, con un alto % en leucina e isoleucina y un bajo contenido en glicina. Todas las viroporinas tienen una región hidrofóbica de 20 aa, que puede formar hélices &- anfipáticas. Además de la zona hidrofóbica, normalmente estas viroporinas contienen aa básicos (algunas toxinas que permeabilizan membranas también los tienen). Estas regiones de aa básicos podrían participar en la permeabilización de membranas por desestabilización de la bicapa lipídica. Las viroporinas tienden a formar oligómeros que se expanden a través de la membrana y forman de esta forma poros hidrofílicos. La principal función de estas proteínas sería la de permitir la salida de las partículas víricas de las células infectadas. Además la expresión de estas proteínas debe tener un efecto sobre las células antes de que la lisis ocurra. Estos efectos se manifestarían en modificaciones en la morfología y metabolismo celular, incluyendo la síntesis de macromoléculas.

Células infectadas por Picornavirus representan quizás el sistema de virus animal en el que más se han estudiado las modificaciones de la permeabilidad de membrana. Sin embargo, aunque en sistemas como citomegalovirus o rotavirus se ha demostrado como la infección por estos virus provoca un aumento en los niveles de Ca2+ intracelular en estadios tardíos de infección. Se ha sugerido que este aumento de Ca2+ pudiera jugar un papel en el efecto citopático inducido por estos virus. No obstante, no se habían estudiado cambios en las concentraciones de Ca2+ intracelular en el virus de la polio.

Es por ello, que decidimos estudiar los posibles cambios en la concentración de Ca2+ intracelular producidos en células HeLa por la infección del virus de la polio. Para ello se hizo uso de una técnica como la citometría de flujo, que no se había utilizado previamente para medir concentraciones de Ca2+ intracelular en células infectadas, utilizando Fluo-3 como sonda de Ca2+ citosólico. A partir de la hora tres post-infección se produce un aumento de Ca2+ intracelular en aproximadamente el 30% de la población celular, que en la hora 4 era de un 70% y en la hora 5 post-infección alcanzaba al 90% de la población. El análisis en paralelo en este experimento de la cinética de síntesis de proteínas virales muestra como estas proteínas virales son detectadas claramente desde la hora 2-3 post- infección, siendo máxima a la hora 3-4 y desapareciendo a la hora 6. Es decir, que la traducción del mRNA vírico tiene lugar en células con cambios drásticos en la concentración de Ca. Además estas variaciones en la concentración de Ca2+ coinciden en el tiempo con cambios en la permeabilidad a cationes monovalentes.

Se comprobó que estos cambios en la concentración de Ca2+ eran consecuencia de la expresión del genes víricos. Para ello las células infectadas se trataron con inhibidores de la síntesis de proteínas (cicloheximida) o con inhibidores de la replicación del genoma vírico (Ro-090179 y guanidina). El hecho de que los tres inhibidores bloquearan el aumento de Ca2+ en células infectadas demuestra que tanto la síntesis de proteínas víricas como la replicación viral son requeridas para modificar la concentración de Ca2+ citosólico. ¿De dónde viene ese aumento de Ca2+ citosólico?. Nosotros vemos dos posibilidades:

1) Que venga de fuera de la célula: se forman poros durante la infección.

2) Otra posibilidad es que el aumento en inositol trifosfato (IP3) producido por la activación de la fosfolipasa C en células infectadas por polio haga que se liberen las reservas de Ca2+ en retículo endoplásmico. El tratamiento con verapamil (inhibidor de canales de Ca2+ tipo L) reduce en un 70% el aumento de Ca2+ citosólico, lo que sugiere que al menos en parte el Ca2+ debe venir del medio extracelular a través de canales de Ca. Esto viene apoyado por el hecho de que células infectadas en ausencia de Ca2+ extracelular no presentan un aumento de Ca2+ citosólico. Compuestos como la tapsigargina, que inhibe la bomba de Ca2+ del RE, no afectan a la concentración de Ca2+ citosólico, lo que sugiere que el aumento de Ca2+ citosólico en la infección no viene del RE. El uso de la citometría de flujo ha permitido delimitar los eventos que preceden la muerte celular de las células infectadas por virus, estudiando la cinética de aumento de permeabilidad al Yoduro de Propidio, las variaciones de Ca2+ y las de tamaño y granulosidad.